脈沖場凝膠電泳

 

當雙鏈DNA分子超過一定的大小以后，DNA雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會達到極限，此時凝膠不能按照分子大小來篩分DNA,脈沖場電泳就解決了這一難題

脈沖電泳是在兩個不同方向的電場，周期性交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子

脈沖場凝膠電泳

1 儀器： WD-2101A脈沖電泳系統(tǒng)

2 配套試劑：脈沖電泳專用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE

3 染料：GelRed等

在凝膠電泳中，溫度越高，DNA移動的速度越快，但是條帶的清晰度和分辨率會明顯下降。溫度過高會導致DNA帶變形或解鏈，一般設置電泳溫度為14℃

常用緩沖液是0.5×TBE

H9812，2.2s-63.8s，19h

脈沖場電泳常見問題及解決辦法

1）凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動泵的速度太快或太慢， 調(diào)到合適的速度

2）緩沖液不流動或流速慢–檢查冷卻泵：當冷卻泵制 冷時，如果蠕動泵沒有開，會造成管道內(nèi)結(jié)冰，導 致管道堵塞

3）電泳條帶扭曲–流速太低，導致制冷不充分，或不 均一、緩沖液的體積不能太小

4）條帶變粗–減少上樣量

5）條帶拖尾或模糊–電場轉(zhuǎn)換時間不合適，優(yōu)化轉(zhuǎn)換 電場轉(zhuǎn)換時間、上樣量太高，調(diào)整樣品濃度

6）大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長電場轉(zhuǎn)換 時間

7）條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降，更換緩沖液、上 樣時樣品塊被擠碎、泵速度太慢

聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在引發(fā)劑（eg.APS）和加速劑（eg.TEMED）的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱PAGE）。
 
聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：

1 在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。

2 化學性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學反應。

3 對pH和溫度變化較穩(wěn)定。

4 幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣 品分離重復性好。

5 樣品不易擴散，且用量少。

6 凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。

7 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和 電荷效應為一體，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。

聚丙烯酰胺凝膠聚合

聚合原理

1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的。 催化系統(tǒng)常用有兩種： 過硫酸氨—TEMED化學催化聚合系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過硫酸氨（APS，引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。

2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。

凝膠孔徑的可調(diào)性及性質(zhì)

1）聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度（T），以及雙體占總濃度的百分含量（C）即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的，而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加

2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動顆粒 穿過網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān)，Bis占Acr總濃度5%時，孔徑最小。

3）凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的相對分子質(zhì)量也不同。在操作時，可根據(jù)被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標準膠)，因為生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。